近場光學(xué)顯微鏡使我們對生物體的生命活動規(guī)律有了更進一步的認識。在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實驗中,大部分要通過顯微鏡來完成,因此,顯微鏡性能的好壞是做好觀察實驗的關(guān)鍵。
近場光學(xué)顯微鏡的機械裝置是顯微鏡的重要組成部分。其作用是固定與調(diào)節(jié)光學(xué)鏡頭,固定與移動標(biāo)本等。主要有鏡座、鏡臂、載物臺、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、與調(diào)焦裝置組成。
一、鏡座和鏡臂:鏡座作用是支撐整個顯微鏡,裝有反光鏡,有的還裝有照明光源。鏡臂作用是支撐鏡筒和載物臺。分固定、可傾斜兩種。
二、載物臺:載物臺作用是安放載玻片,形狀有圓形和方形兩種,其中方形的面積為120mm×110mm。中心有一個通光孔,通光孔后方左右兩側(cè)各有一個安裝壓片夾用的小孔。分為固定式與移動式兩種。有的載物臺的縱橫坐標(biāo)上都裝有游標(biāo)尺,一般讀數(shù)為0.1mm,游標(biāo)尺可用來測定標(biāo)本的大小,也可用來對被檢部分做標(biāo)記。
三、鏡筒:鏡筒上端放置目鏡,下端連接物鏡轉(zhuǎn)換器。分為固定式和可調(diào)節(jié)式兩種。機械筒長不能變更的叫做固定式鏡筒,能變更的叫做調(diào)節(jié)式鏡筒。
四、物鏡轉(zhuǎn)換器:物鏡轉(zhuǎn)換器固定在鏡筒下端,有3—4個物鏡螺旋口,物鏡應(yīng)按放大倍數(shù)高低順序排列。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器時,應(yīng)用手指捏住旋轉(zhuǎn)碟旋轉(zhuǎn),不要用手指推動物鏡,因時間長容易使光軸歪斜,使成像質(zhì)量邊壞。
五、調(diào)焦裝置:近場光學(xué)顯微鏡上裝有粗準(zhǔn)焦螺旋和細準(zhǔn)焦螺旋。有的顯微鏡粗準(zhǔn)焦螺旋與裝在同一軸上,大螺旋為粗準(zhǔn)焦螺旋,小螺旋為細準(zhǔn)焦螺旋;有的則分開安置,位于鏡臂的上端較大的一對螺旋為是粗準(zhǔn)焦螺旋,其轉(zhuǎn)動一周,鏡筒上升或下降10mm。
近場光學(xué)顯微鏡一般由載物臺、聚光照明系統(tǒng)、物鏡,目鏡和調(diào)焦機構(gòu)組成。載物臺用于承放被觀察的物體。利用調(diào)焦旋鈕可以驅(qū)動調(diào)焦機構(gòu),使載物臺作粗調(diào)和微調(diào)的升降運動,使被觀察物體調(diào)焦清晰成象。它的上層可以在水平面內(nèi)沿作精密移動和轉(zhuǎn)動,一般都把被觀察的部位調(diào)放到視場中心。
聚光照明系統(tǒng)由燈源和聚光鏡構(gòu)成,聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應(yīng)。物鏡位于被觀察物體附近,是實現(xiàn)*級放大的鏡頭。在物鏡轉(zhuǎn)換器上同時裝著幾個不同放大倍率的物鏡,轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進入工作光路,物鏡的放大倍率通常為5~100倍。
物鏡是顯微鏡中對成象質(zhì)量優(yōu)劣起決定性作用的光學(xué)元件。常用的有能對兩種顏色的光線校正色差的消色差物鏡;質(zhì)量更高的還有能對三種色光校正色差的復(fù)消色差物鏡;能保證物鏡的整個像面為平面,以提高視場邊緣成像質(zhì)量的平像場物鏡。高倍物鏡中多采用浸液物鏡,即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體,它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
目鏡是位于人眼附近實現(xiàn)第二級放大的鏡頭,鏡放大倍率通常為5~20倍。按照所能看到的視場大小,目鏡可分為視場較小的普通目鏡,和視場較大的大視場目鏡(或稱廣角目鏡)兩類。
近場光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器,已有300多年的發(fā)展史。自從有了顯微鏡,人們看到了過去看不到的許多微小生物和構(gòu)成生物的基本單元——細胞。不僅有能放大千余倍的光學(xué)顯微鏡,而且有放大幾十萬倍的電子顯微鏡,使我們對生物體的生命活動規(guī)律有了更進一步的認識。近場光學(xué)顯微鏡在普通中學(xué)生物教學(xué)大綱中規(guī)定的實驗中,大部分要通過顯微鏡來完成,因此,顯微鏡性能的好壞是做好觀察實驗的關(guān)鍵。
近場光學(xué)顯微鏡使用方法
1.使用單筒顯微鏡時,要養(yǎng)成用左眼觀察的習(xí)慣(因一般用右手畫圖),觀察時要兩眼同時睜開,不要睜一只閉一只,因為這樣易于疲勞。為了訓(xùn)練學(xué)生習(xí)慣于兩眼同時睜開觀察,可剪一塊長約14cm,寬約6cm的長方形硬紙片,在靠近左端處挖一個直徑比鏡筒上端外徑略小的圓孔,把圓孔套在鏡筒上段,觀察時兩眼同時睜開,利用紙片的右端擋住右眼的視線,這樣訓(xùn)練一段時間后,就能習(xí)慣于兩眼同時睜開,然后把紙片去掉。
2.直筒顯微鏡的鏡臂與鏡座連接處,是一個機械關(guān)節(jié),可用于調(diào)節(jié)鏡筒的傾斜度,便于觀察,鏡臂不能過于后傾,一般不超過40°。但是在使用臨時裝片觀察時,禁止使用傾斜關(guān)節(jié)(當(dāng)鏡筒傾斜時,載物臺也隨之傾斜,載玻片上的液體易流出),尤其是裝片內(nèi)含酸性試劑時嚴(yán)禁使用,以免污損鏡體。
3.目鏡和物鏡的使用
一般都是用一個放大倍數(shù)適中的目鏡(10×)和zui低倍的物鏡開始觀察,逐步改用倍數(shù)較高的物鏡,從中找到符合實驗要求的放大倍數(shù)。
轉(zhuǎn)換物鏡時,先用低倍鏡觀察,調(diào)節(jié)到正確的工作距離(成像zui清晰)。如果進一步使用高倍物鏡觀察,應(yīng)在轉(zhuǎn)換高倍物鏡之前,把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央(將低倍物鏡轉(zhuǎn)換成高倍物鏡觀察時,視野中的物像范圍縮小了很多)。低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦(同高調(diào)焦)。
通常認為,使用任何一個物鏡時,有效放大倍數(shù)的上限是1,000乘它的數(shù)值孔徑,下限是250乘它的數(shù)值孔徑。如40×物鏡的數(shù)值孔徑是0.65,則上、下限分別為:1000×0.65=650倍和250×0.65≈163倍,超過有效放大倍數(shù)上限的叫做無效放大,不能提高觀察效果。低于下限的放大倍數(shù)則人眼無法分辨,不利于觀察。一般*的放大倍數(shù)范圍是500—700乘數(shù)值孔徑之間的數(shù)字。
4.油浸物鏡的使用
近場光學(xué)顯微鏡使用油浸物鏡時,一般不要使用同高調(diào)焦。同高調(diào)焦只適用于每臺顯微鏡的原配物鏡,在使用低倍和高倍物鏡時,是一個有利的方便條件,但在使用油浸物鏡時,則受到一定限制,一般地說,用油鏡觀察未加蓋玻片的標(biāo)本片(載玻片)時,利用同高調(diào)焦的安全度較大,而對于有蓋玻片的標(biāo)本片,要小心使用,因為油浸物鏡的工作距離很短,在設(shè)計和裝配時所考慮的同高是對標(biāo)準(zhǔn)厚度蓋玻片的。
載物臺和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對運動以實現(xiàn)調(diào)焦,獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時,容許的調(diào)焦范圍往往小于微米,所以顯微鏡必須具備為精密的微動調(diào)焦機構(gòu)。顯微鏡放大倍率的限即有效放大倍率,近場光學(xué)顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個物點的zui小間距。分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有的概念。
當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時,顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu),此時即使過度地增大放大倍率,得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像,稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力,應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。
聚光照明系統(tǒng)是對顯微鏡成像性能有較大影響,但又是易于被使用者忽視的環(huán)節(jié)。近場光學(xué)顯微鏡的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發(fā)來的光束應(yīng)能保證充滿物鏡孔徑角,否則就不能充分利用物鏡所能達到的zui高分辨率。為此目的,在近場光學(xué)顯微鏡中設(shè)有類似照相物鏡中的,可以調(diào)節(jié)開孔大小的可變孔徑光闌,用來調(diào)節(jié)照明光束孔徑,以與物鏡孔徑角匹配。
改變照明方式,可以獲得亮背景上的暗物點(稱亮視場照明)或暗背景上的亮物點(稱暗視場照明)等不同的觀察方式,以便在不同情況下更好地發(fā)現(xiàn)和觀察微細結(jié)構(gòu)。